ПРОТЕКТОРНИЙ ЕФЕКТ МУЛЬТИПОТЕНТНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН НА МОДЕЛІ ПЕРИВЕНТРИКУЛЯРНОЇ ЛЕЙКОМАЛЯЦІЇ IN VITRO
Цупиков О. 1,2, Лушнікова І. 1, Устименко А. 2, Кирик В. 2, Нікандрова Є. 1, Пацева М. 1, Яценко К. 1, Бутенко Г. 2, Скибо Г. 1,2
1Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця Національної академії наук України, Київ;
2ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини Національної академії медичних наук України», Київ.
Перивентрикулярна лейкомаляція (ПВЛ) – це форма ураження білої речовини головного мозку, яка виникає в результаті гіпоксично-ішемічного ушкодження і/або запалення нервової тканини, і є однією з причин розвитку дитячого церебрального паралічу. На моделях ПВЛ in vivo нами було продемонстровано нейропротекторний ефект трансплантації мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (ММСК). Однак механізми, за допомогою яких трансплантовані ММСК реалізують свою нейропротекторну дію, лишаються не дослідженими.
Метою роботи була оцінка дії ММСК на культивовані зрізи головного мозку при їх співкультивуванні на моделі ПВЛ in vitro.
Методи. Перивентрикулярну лейкомаляцію in vitro моделювали шляхом 30-хвилинної киснево-глюкозної депривації (КГД) зрізів головного мозку миші з подальшим додаванням у культуральне середовище 100 нг/мл ліпополісахариду. Для співкультивування використовували ММСК жирової клітковини, отримані від мишей лінії FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J, трансгенних за зеленим флуоресцентним білком (GFP). Життєздатність клітин культивованих зрізів оцінювали за допомогою аналізу рівня лактатдегідрогенази (ЛДГ) у культуральному середовищі. Ймовірну диференціацію ММСК у нейрони та гліальні клітини досліджували за допомогою імуногістохімічного фарбування зрізів з використанням специфічних антитіл до нейронів та олігодендроцитів (NeuN та Oligodendrocytes, відповідно).
Результати. Моделювання ПВЛ in vitro на органотиповій культурі зрізів мозку призводило до значного збільшення рівня цитозольного ферменту ЛДГ у культуральному середовищі. Співкультивування зрізів з ММСК при ПВЛ зменшувало кількість цього ферменту. Крім того, показано, що за умов ПВЛ in vitro, ММСК здатні диференціюватися у клітини нервової тканини.
Висновки. ММСК мають протекторний ефект при їх співкультивуванні із зрізами головного мозку на моделі ПВЛ in vitro. Можливий механізм такої нейропротекторної дії ММСК пов’язаний, ймовірно, як із заміною ушкоджених клітин шляхом диференціації та інтеграції трансплантованих клітин, так і з іншими чинниками, такими як модуляція запалення і трофічні фактори.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: перивентрикулярна лейкомаляція, ліпополісахариди, органотипова культура зрізів головного мозку, мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини.
ВСТУП
Перивентрикулярна лейкомаляція (ПВЛ) – форма ураження білої речовини головного мозку, яка характеризується загибеллю олігодендроцитів – клітин, відповідальних за мієлінізацію аксонів, а також астро- та мікрогліозом у перивентрикулярній зоні мозку [2, 7]. Пошкодження мієлінізації аксонів призводить до розладу мозкової сигналізації, що проявляється в погіршенні моторного контролю, затримці фізичного, інтелектуального та емоційного розвитку дитини [2, 4, 21]. У результаті недорозвинення або пошкодження мозку в пренатальний, інтранатальний та ранній постнатальний періоди, може виникати група синдромів, які об’єднуються терміном «дитячий церебральний параліч» (ДЦП).
Існує безліч можливих причин ПВЛ, основними з яких є гіпоксично-ішемічні ураження головного мозку, аутоімунні механізмі в системі мати-плід, внутрішньоутробні інфекції, особливо вірусні, та ін. Останнім часом істотну роль у патогенезі ПВЛ надають нейронімунному конфлікту в системі мати-плід, що призводить до порушення розвитку як ЦНС, так і імунокомпетентних систем плода [9, 10, 22].
Сучасна фармакологічна терапія перинатальної патології ЦНС залишається недосконалою і здатна порушити складний взаємозв’язок компенсаторно-пристосувальних процесів у організмі дитини, що нерідко призводить до виникнення ускладнень, які унеможливлюють подальше проведення медикаментозної терапії [21]. Реабілітаційні заходи в таких випадках повинні бути проведені в перші місяці життя, коли можна очікувати найбільший відновлюваний ефект.
Клітинна терапія із використанням стовбурових клітин – це перспективний підхід для лікування різноманітних захворювань ЦНС, зокрема ПВЛ [6, 12, 16]. Незважаючи на численні дослідження у цьому напрямку, відкритим залишається питання не тільки про допоміжну роль клітин трансплантату в регенерації, але й про можливість трансдиференціювання інших, відмінних від нейральних стовбурових клітин, наприклад мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (ММСК), в нейрони або гліальні клітини [5, 17]. ММСК мають тропність до зони пошкодження та можуть впливати на перебіг процесів запалення і репарації в ній [1]. Вони забезпечують толерантність імунної системи реципієнта до алогенних клітин, власне для самих себе. При цьому використання аутологічних ММСК дозволило б вирішити питання імунологічної сумісності трансплантованого матеріалу і тестування його на інфекції, а також уникнути етичних та юридичних проблем з приводу фетального донорського матеріалу [3]. Було показано, що при трансплантації ММСК жирової клітковини на моделі геморагічного інсульту у щурів послаблюється неврологічний дефіцит, знижується атрофія мозку, істотно зменшується зона ішемічного інфаркту та зростає кількість дрібних судин [8]. У попередній роботі на моделі перивентрикулярної лейкомаляції in vivo ми продемонстрували нейропротекторний ефект трансплантації ММСК жирової клітковини [18]. Проте, розкриття механізмів, за допомогою яких трансплантовані ММСК сприяють виживанню клітин і функціональному відновленню тварин, потребує подальших досліджень.
У цій роботі ми вивчали ефект дії ММСК на культивовані зрізи головного мозку при їх співкультивуванні на моделі ПВЛ in vitro.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Усі експерименти на тваринах виконані з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях (European convention, Strasburg, 1986), статті 26 Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження” (№ 3447-IV, 21.02.2006), а також усіх норм біоетики та біологічної безпеки.
У нашому дослідженні ми використовували мишей лінії FVB “дикого” типу та FVB-C-Tg (GFPU) 5Nagy/J, трансгенних за зеленим флуоресцентним білком (GFP). Миші були люб’язно надані Європейської лабораторією молекулярної біології (Monterotondo, Італія).
Органотипова культура зрізів головного мозку мишей.
Органотипову культуру зрізів головного мозку отримували з мишей лінії FVB 7-денного віку. Після швидкої декапітації виділяли мозок, розділяли його на дві частини по серединній лінії та за допомогою автоматичного чоппера (McIllwain, Англія) робили зрізи завтовшки 350 мкм. Зрізи культивували на пористих напівпроникних нітроцелюлозних мембранах (Millicell-CM, Millipore, MA), розміщених у СО2-інкубаторі на межі газового (суміш атмосферного повітря з 5% СО2) та рідкого середовища (50 % МЕМ, 25 % збалансованого сольового розчину Хенкса, 25 % інактивованої кінської сироватки, 10 мM Трис, 2 мM NaHCO3, 12,5 мM HEPES, 15 мM глюкози, 100 од/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину, рН 7.2) у 6-лункових планшетах при +35 0С. Середовище культивування змінювали на другий день інкубації та далі двічі на тиждень.
Отримання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин з жирової клітковини GFP-позитивних мишей.
Жирова клітковина мишей лінії FVB-Cg-Tg(GFPU)5Nagy/J, трансгенних за геном GFP, була використана для отримання ММСК. Клітинна суспензія культивувалась у повному поживному середовищі ДМЕМ-LG, яке містило 15 % ФБС (HyClon, USA), антибіотики (пеніцилін 100 од/мл, стрептоміцин 100 мкг/мл, (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1:100 nonessential amino acids (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в СО2–інкубаторі в умовах зволоженого повітря з 5 % СО2 при температурі + 37 0С.
Моделювання перивентрикулярної лейкомаляції на органотиповій культурі зрізів головного мозку мишей та в умовах співкультивування з ММСК.
Перивентрикулярну лейкомаляцію моделювали шляхом киснево-глюкозної депривації (КГД) зрізів головного мозку з подальшим додаванням у культуральне середовище ендотоксину ліпополісахариду (ЛПС) для імітації процесу запалення. КГД створювалась у спеціальній камері з безкісневим газовим середовищем, яке містило 95 % азоту (N2) і 5 % СО2. Для КГД, нормальне середовище для культивування замінювалося на РBS, 12,5 ммоль Hepes з додаванням сахарози (10 ммоль D-сахарози) замість глюкози. Тривалість КГД становила 30 хвилин, після чого зрізи двічі відмивалися і поверталися до нормальних умов культивування (нормоксична реоксигенація протягом 24 та 48 годин). Після КГД у культуральне середовище додавали 100 нг/мл ЛПС (L4130, Sigma-Aldrich, США).
Для контактного співкультивування ММСК зі зрізами головного мозку мишей лінії FVB використовували GFP-позитивні ММСК 2-3 пасажів, які наносили безпосередньо на культивований зріз мозку (25 000 клітин на один зріз) перед моделюванням ПВЛ.
Кількісна оцінка лактатдегідрогенази (ЛДГ) у культуральному середовищі.
Визначення змін відносної кількості цитозольного ферменту ЛДГ у культуральному середовищі проводилося колориметричним методом за допомогою тест-набору G1780 (“Promega”, USA). Під час пошкодження клітинної мембрани ЛДГ вивільняється у культуральне середовище та характеризує ступінь ушкодження клітин. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості ферменту ЛДГ у середовищі культивування та обернено пропорційна життєздатності клітин у культурі.
Після проведення експериментів на органотипових зрізах мозку відбирали 200 мкл культурального середовища в 24-лунковий планшет. У кожну лунку додавали 200 мкл субстрату для визначення ЛДГ. Проби інкубували при кімнатній температурі в темряві протягом 30 хв. Потім додавали 200 мкл розчину, що зупиняв реакцію (набір G1780). Оптичну щільність проб вимірювали за допомогою спектрофотометру uniSPEC 2 (LLG, Німеччина) у мікрокюветах при довжині хвилі 492 нм. Проби відбиралися через 24 та 48 годин після експериментальних впливів у дублях та визначали середнє значення для кожної лунки. Зміни відносної кількості ЛДГ у культуральному середовищі виражали в умовних одиницях. Умовні одиниці відповідали одиницям оптичної щільності розчину, які були співвіднесені до площі тканини у відповідній лунці та нормалізовані до контролю.
Імуногістохімічний аналіз органотипової культури зрізів головного мозку.
Ідентифікацію трансплантованих клітин та оцінку ступеня ушкодження нервової тканини, спричиненого ПВЛ, було проведено методом імуногістохімії з використанням первинних та вторинних антитіл, кон’югованих з флуоресцентними барвниками AlexaFlour на 14 добу після нанесення ММСК на органотипову культуру. Зрізи головного мозку мишей фіксували 4% розчином формальдегіду на 0.1 М фосфатному буфері (ФБ). Зафіксовані зрізи блокували у розчині 0.1 М ФБ (рН 7.4) з додаванням 0.5% бичачого сироваткового альбуміну та 0.3% Тритон Х-100. Інкубацію зрізів у розчині первинних антитіл робили протягом 12 годин при + 4 0С. Були використані такі первинні антитіла: анти-GFP (маркер трансплантованих клітин), розведення 1:7000 (Novus Biologicals, США); анти-NeuN (маркер нейронних ядер), 1:1000 (Millipore, США) та анти-Oligodendrocytes (маркер олігодендроцитів), 1:1000 (Sigma-Aldrich, США). Первинні антитіла візуалізували відповідними вторинними антитілами, кон’югованними з флуорохромом AlexaFluor (Invitrogen, США). Надалі органотипові культури зрізів головного мозку покривали середовищем Immu-MOUNT (Thermo Scientific, США). Імуноцитохімічно забарвлену культуру досліджували за допомогою конфокального скануючого мікроскопа FV1000-BX61WI (Olympus, Японія).
Статистичний аналіз.
Статистичний аналіз виконували за допомогою програмного забезпечення “Origin Pro8.5” (“OriginLab Corporation” США). Вибірка даних включала результати, отримані з 3 експериментів. Результати наведені у вигляді середнього арифметичного з 4 значень (n=4) у кожній експериментальній групі ± стандартна похибка середнього (SEM). Дані характеризувалися нормальним розподілом, статистична вірогідність різниць визначалась парним t-критерієм Стьюдента, відмінності вважалися достовірними при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ
Оцінка життєздатності по ЛДГ.
У цій роботі було використано попередньо розроблену нами модель ПВЛ in vitro, в якій моделювання ураження білої речовини головного мозку досягалося шляхом киснево-глюкозної депривації (КГД) культивованих зрізів головного мозку та додаванням ендотоксину ліпополісахариду (ЛПС) у культуральне середовище [19].
Для співкультивування ММСК зі зрізами головного мозку культивовані клітини переводили із адгезивного стану в суспензію та наносили безпосередньо на культивований зріз (25 000 клітин на один зріз) перед моделюванням ПВЛ. Близько 10% нанесених на зріз GFP-позитивних клітин прикріплялися до культивованого зрізу (Рис. 1). Решта ММСК розподілялися на поверхні пористої мембрани.
Рис. 1. Мікрофото культивованого зрізу головного мозку миші А – фазово-контрастне зображення. Квадратом позначена ділянка, яка показана на (Б). Б – GFP-позитивні ММСК (зелений колір) після нанесення на культивований зріз у поєднанні з фазовим контрастом. Шкала: А – 500 мкм, Б – 50 мкм.
Для аналізу ступеня пошкодження нервової тканини в процесі моделювання ПВЛ in vitro та ефекту співкультивування ММСК зі зрізами мозку на цій моделі використовували спектрофотометричний метод визначення ЛДГ.
Виявлено, що через 24 та 48 годин від початку моделювання ПВЛ in vitro відносна кількість ЛДГ у культуральному середовищі збільшувалася порівняно із контрольними зрізами в 3,1 раза та 4,3 раза відповідно (Рис. 2). Співкультивування з ММСК достовірно зменшувало кількість ЛДГ порівняно із ПВЛ, як після 24, так і після 48 годин (у 2,4 раза, та в 1,9 раза, відповідно) (Рис. 2).
Рис. 2 . Відносна кількість ферменту ЛДГ у культуральному середовищі органотипових зрізів через 24 та 48 годин від початку моделювання ПВЛ in vitro (ПВЛ) в умовах окремого культивування зрізів та сумісно з ММСК. * – статистично достовірна відмінність порівняно з контролем, # – статистично достовірна відмінність порівняно з ПВЛ (p<0,05).
Також досліджували вплив ПВЛ in vitro на життєздатність ММСК у культурі. Показано, що через 24 та 48 годин після моделювання ПВЛ in vitro відносна кількість ЛДГ у культуральному середовищі ММСК достовірно не змінювалася порівняно із контрольними значеннями (без моделювання ПВЛ in vitro) (Рис. 3). Тобто, моделювання ПВЛ in vitro істотно не впливало на життєздатність ММСК у культурі, що свідчить про високу стійкість ММСК до ушкоджуючи чинників, використаних для моделювання ПВЛ у даному експерименті (зокрема 30-хв КГД та 100 нг ЛПС).
Рис. 3 . Вплив ПВЛ in vitro на життєздатність ММСК. А – мікрофото культури ММСК. Б – гістограма, що демонструє відносну кількість ферменту ЛДГ у культуральному середовищі ММСК через 24 та 48 годин після моделювання ПВЛ in vitro. Шкала – 300 мкм.
Таким чином, результати спектрофотометричного аналізу продемонстрували, що співкультивування органотипових зрізів з ММСК мало нейропротекторний характер і зменшувало пошкоджуючий вплив ПВЛ на зрізи головного мозку.
Імуногістохімічний аналіз органотипової культури зрізів головного мозку.
Імуногістохімічний аналіз показав, що на 14-у добу співкультивування GFP-позитивних ММСК із органотиповимми зрізами головного мозку значна кількість ММСК виживала, зберігала фенотипічні ознаки та залишалася у недиференційованому стані. Приблизно 5 % GFP-позитивних ММСК, що прикріпилися до культивованого зрізу, диференціювалися в NeuN-позитивні зрілі нейрони (Рис. 4А1-А3) або олігодендроцити (Рис. 4Б1-Б3).
Рис.4. Імуногістохімічний аналіз сумісної культури GFP-позитивних ММСК та зрізів головного мозку миші на 14-у добу співкультивування. А1 – конфокальне зображення зрізів, пофарбованих на маркер нейронів (NeuN), А2, – GFP-позитивні ММСК, А3 – накладення зображень А1 і А2; Б1 – конфокальне зображення зрізів, пофарбованих на маркер олігодендроцитів (oligodendrocytes), Б2 – GFP-позитивні ММСК, Б3 – накладення зображень Б1 і Б2. Шкала – 100 мкм.
Отже, результати нашого дослідження свідчать про те, що ММСК здатні диференціюватися у клітини нервової тканини при моделюванні ПВЛ in vitro і мають протекторний вплив на культивовані зрізи головного мозку.
Можливі механізми нейропротекторної дії ММСК можуть бути пов’язані як із заміною ушкоджених клітин шляхом диференціації та інтеграції трансплантованих клітин, так і з біоактивними чинниками, здатними модулювати розвиток ушкодження при ПВЛ. Вважають, що нейропротекторні властивості ММСК реалізуються здебільшого не прямо через диференціювання, а паракринно завдяки різноманітним факторам, які індукують міграцію ендогенних нейральних прогеніторів у зону пошкодження, стимулюють ріст дендритів і аксонів та зменшують постішемічне запалення [11, 13, 20]. Було показано, що кондиційне середовище з ММСК захищало культуру нейронів від індукованого апоптозу [23]. ММСК модулюють численні сигнальні каскади під час нейрогенезу, ангіогенезу, синаптогенезу та апоптозу за допомогою трансмітерів шляхом секреції фактора росту фібробластів (FGF-2), епідермального фактора росту (EGF), нейротрофічного фактора гліальних клітин (GDNF) та ін. [20]. ММСК також продукують високий рівень цитокінів, які залучені в процеси проліферації клітин та регенерації тканин, таких як IGF-1 (insulin-like growth factor-1), VEGF-a (vascular endothelial growth factor-a), SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) та еритропоетин [14].
Відомо про вплив трансплантованих ММСК на тканини реципієнта шляхом диференціації у клітини, специфічні для місця трансплантації [15]. Є дані, які підтверджують, що ММСК із жирової клітковини сприяли морфологічному і функціональному відновленню пошкоджень спинного мозку. Вони експресували гліальні маркери GFAP, β-тубулін-3 і нейрофіламенти NF160 [15]. Наші дослідження продемонстрували, що за умов ПВЛ при контактному співкультивуванні ММСК зі зрізами головного мозку певна кількість трансплантованих ММСК диференціювалися у нейрони та олігодендроцити, оскільки експресували маркери зрілих нейронів та олігодендроцитів (Рис. 4).
Незважаючи на значну кількість даних, яка свідчить про позитивний ефект трансплантації ММСК при різних захворюваннях ЦНС, впровадження в клінічну практику методик трансплантації стовбурових клітин потребує додаткових досліджень та має базуватися на глибокому розумінні механізмів їх функціонування та достатньому експериментальному матеріалі. Вивчення зазначеного кола питань можливе в умовах експериментальної трансплантації із залученням адекватних моделей цієї патології. Використана in vitro модель є адекватною для вивчення механізмів та засобів нейропротекції при ПВЛ.
Подяка
Дослідження проведено за підтримки цільової академічної програми “Функціональна геноміка і метаболоміка в системній біології” (номер державної реєстрації 0112U001475), та в межах проекту «Дослідження регенеративного потенціалу мезенхімальних стовбурових клітин при перинатальній патології ЦНС» (номер державної реєстрації 0115U003633).
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Ahn S.Y., Chang Y.S., Park W.S. Mesenchymal stem cells transplantation for neuroprotection in preterm infants with severe intraventricular hemorrhage // Korean J. Pediatr. – 2014. – Vol. 57, № 6. – Р. 251–256.
2. Blumenthal I. Periventricular leukomalacia: a review. Eur J Pediatr. 2004;163(8):435-442.
3. Chernykh E.R., Kafanova M.Y., Shevela E.Y., Sirota S.I., Adonina E.I., Sakhno L.V., Ostanin A.A., Kozlov V.V. Clinical experience with autologous M2 macrophages in children with severe cerebral palsy // Cell Transplant. – 2014. – Vol. 23, Suppl 1. – S97–104.
4. Gano D, Andersen SK, Partridge JC, et al. Diminished white matter injury over time in a cohort of premature newborns. J Pediatr. 2015;166(1):39–43. doi: 10.1016/j.jpeds.2014.09.009;
5. Isik S., Zaim M., Yildiz M.T., Negis Y., Kunduraci T., Karakas N., Arikan G., Cetin G. DNA topoisomerase IIβ as a molecular switch in neural differentiation of mesenchymal stem cells // Ann. Hematol. – 2015. – Vol. 94, №2. – 3. – Р. 7–18.
6. Kan I., Melamed E., Offen D. Autotransplantation of bone marrowderived stem cells as a therapy for neurodegenerative diseases, Handb. Exp. Pharmacol. (180) (2007) 219–242.
7. Khwaja O, Volpe JJ. Pathogenesis of cerebral white matter injury of prematurity. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2008;93(2):F153-161. doi: 10.1136/adc.2006.108837
8. Kim JM, Lee ST, Chu K, Jung KH, Song EC, Kim SJ, Sinn DI, Kim JH, Park DK, Kang KM, Hyung Hong N, Park HK, Won CH, Kim KH, Kim M, Kun Lee S, Roh JK. Systemic transplantation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model. Brain Res (2007) 1183: 43–45.
9. Knuesel I., Chicha L., Britschgi M., Schobel S.A., Bodmer M., Hellings J.A., Toovey S., Prinssen E.P. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders // Nat. Rev. Neurol. – 2014. – Vol. 10, № 11. – Р. 643– 660.
10. Launay E., Gras-Le Guen C., Martinot A., Assathiany R., Martin E., Blanchais T., Deneux-Tharaux C., Rozé J.C., Chalumeau M. Why children with severe bacterial infection die: a population-based study of determinants and consequences of suboptimal care with a special emphasis on methodological issues // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, №9. – е107286., 320.
11. Lee J. A., B. I. Kim, C. H. Jo, et al. Mesenchymal stem-cell transplantation for hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rat model // Pediatric Research. – 2010. – Vol. 67, No 1. – P. 42 – 46.
12. Lindvall O., Kokaia Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders– time for clinical translation? J. Clin. Invest. 120 (1) (2010) 29–40.
13. Linero I, Chaparro O. Paracrine effect of mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue in bone regeneration. PLoS One. 2014;9(9):e107001.
14. Rasmussen JG, Frøbert O, Pilgaard L, Kastrup J, Simonsen U, Zachar V, Fink T. Prolonged hypoxic culture and trypsinization increase the pro-angiogenic potential of human adipose tissue-derived stem cells. Cytotherapy. 2011;13(3):318-328.
15. Ryu HH, Lim JH, Byeon YE, Park JR, Seo MS, Lee YW, Kim WH, Kang KS, Kweon OK. Functional recovery and neural differentiation after transplantation of allogenic adipose-derived stem cells in a canine model of acute spinal cord injury. J Vet Sci. 2009;10(4):273-84.
16. Sadan O., Melamed E., Offen D. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for neurodegenerative diseases, Expert Opin. Biol. Ther. 9 (12) (2009) 1487–1497.
17. Tsai H.L., Deng W.P., Lai W.F., Chiu W.T., Yang C.B., Tsai Y.H., Hwang S.M., Renshaw P.F. Wnts enhance neurotrophin-induced neuronal differentiation in adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells via canonical and noncanonical signaling pathways // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, № 8. – e104937.
18. Tsupykov OM, Kyryk VM, Ustymenko AM, et al. Effect of transplantation of adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells on the nervous tissue and behavioral responses in a mouse model of periventricular leukomalacia. Cell and Organ Transplantology. 2015;3(1):68-73.
19. Tsupykov OM, Lushnikova IV, Nikandrova YA, et al. A novel model of periventricular leukomalacia on mouse organotypic brain slice culture. Cell and Organ Transplantology. 2016; 4(2):188-193. doi:10.22494/cot.v4i2.60
20. Velthoven C.T.J., Kavelaars A., Heijnen C. J. Mesenchymal stem cells as a treatment for neonatal ischemic brain damage // Pediatric Research. – 2012. – Vol. 71, No 4. – Р. 474 – 481.
21. Volpe JJ. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet Neurol. 2009;8(1):110-124 doi: 10.1016/S1474-4422(08)70294-1
22. Wang L.W., Lin Y.C., Wang S.T., Yeh T.F., Huang C.C. Hypoxic/ischemic and infectious events have cumulative effects on the risk of cerebral palsy in very-low-birth-weight preterm infants // Neonatology. – 2014. – Vol. 106, №3. – Р. 209–215.
23. Wei X, Zhao L, Zhong J, Gu H, Feng D, Johnstone BH, March KL, Farlow MR, Du Y. Adipose stromal cells-secreted neuroprotective media against neuronal apoptosis. Neurosci Lett. 2009;462(1):76-9.
